接着前五篇有关R-loop CUT&Tag的系列文章,包括R-loop概览、R-loop与表观遗传、R-loop与转录终止、R-loop CUT&Tag 系列文章之四-R-loop CUT&Tag技术原理和技术对比和R-loop CUT&Tag系列文章之五:上海嘉因实操R-loop CUT&Tag数据大解密,本篇文章将介绍R-loop与基因组稳定性的关联性。
当活跃转录区域形成DNA单链断裂或双链断裂 (double-stranded break, DSB) 时,会触发多种修复途径,使断裂附近的转录下调。这其中包括检查点介导的Pol II移除和暂停,后者还可以增加R-loop的稳定性。此外,损伤位点周围的局部染色质结构会变得更具抑制性,使转录减少。有趣的是,PRC1和PRC2都以R-loop依赖的方式定位于某些启动子,也定位于断裂处并通过H2AK119泛素化诱导转录沉默。
RNA-DNA杂交体/R-loop在部分断裂位点处积累,特别是在基因转录区域,并积极促进DNA修复。DNA双链断裂处RNA-DNA杂交体/R-loop的产生可能是由基因内的转录停滞。但也可能存在其他机制,例如在DNA损伤位点,在断裂位点的游离3’端从头转录产生损伤诱导的lncRNA或者已存在的转录物重新退火,这些都可能有助于RNA-DNA杂交体/R-loop的积累。RNA-DNA杂交体/R-loop吸引BRCA1,并招募其他修复因子包括BRCA2、PALB2(BRCA2的伴侣和定位子)和XPG。而后通过RNA解旋酶Senataxin、核糖核酸酶H1(RNase H1)、RNase H2或DEAD-box解旋酶1(DDX1)去除杂交体/R-loop,以允许RAD51加载和同源重组的发生。
TERRA(telomeric repeat-containing RNA)通常在染色体末端形成R-loop,这可能是由于其存在重复的富含G的序列,该序列可能通过在游离的DNA链上形成G4结构来增强R-loop。与大部分R-loop类似,TERRA R-loop也是瞬时的。但当端粒因断裂或者因复制逐渐变短而变得极短时,RNase H酶不再能够有效的定位在端粒处,R-loop则可以稳定存在。在酵母中,短端粒上稳定的R-loop可以促进其与长端粒重组,防止早衰的发生。在短端粒处,TERRA R-loop的累积可以通过RAD51介导的同源依赖性修复促进修复。目前还不确定TERRA是否能在短端粒形成反式R-loop,同时R-loop去除途径尚未确定。
着丝粒基因座转录成着丝粒RNA,同时含有着丝粒R-loops(centromeric R-loops,CEN R-loops),CEN R-loop以依赖细胞周期的方式被调控,这是在酵母和人类之间的保守特征。
DNA复制后在着丝粒形成CEN R-loop,其游离的ssDNA与复制蛋白A(replication protein A,RPA)结合并招募DNA损伤反应激酶ATR。ATR催化多种磷酸化事件并激活Aurora B,精确促进微管与动粒的附着和染色体分离。
上述R-loop与基因组稳定性总结如下表:
序号 | R-loop中RNA | R-loop位置 | 功能及影响 |
1 | 损伤诱导的lncRNA和DSB上的其他RNA | 转录区域的DSB | RAD51募集和同源重组 |
2 | TERRA | 端粒 | 同源重组修复短端粒 |
3 | 着丝粒RNA | 着丝粒 | 激活Aurora B和着丝点功能 |