R-loop CUT&Tag 系列文章之四-R-loop CUT&Tag技术原理和技术对比

2024-10-16 16:40
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全基因组水平R-loop定位方法






R-loop是特殊的三链核酸结构，包括DNA：RNA杂合链和一条游离的DNA单链，广泛存在于各种生物的基因组中，包括细菌、酵母、植物和人类等（R-loop CUT&Tag系列文章之一：R-loop概览——结构、形成、分布、调控因子及病理生理功能）。在生物体内，调控因子精准调控R-loop的产生，在基因调控和基因组稳定上发挥重要作用（R-loop CUT&Tag系列文章之二：R-loop与表观调控R-loop CUT&Tag系列文章之三：R-loop与转录终止）。
为了深入研究R-loop的形成和功能，近年来科学家们一直在开发全基因组水平上的R-loop研究方法，这些方法主要分为两种策略，一种是基于S9.6抗体的免疫共沉淀，另一种是基于失活的RNase H1的免疫共沉淀。在失活RNase H1策略中，需要外源导入或者体外表达失活的RNase H1，这给实验操作带来了难度，而S9.6抗体策略对操作者更加友好，因此目前主流的R-loop检测策略是基于S9.6抗体，最早被开发的是基于S9.6抗体的DRIP-seq，该方法用限制性内切酶对基因组进行片段化，然后利用S9.6抗体疫共沉淀R-loop得到S9.6和R-loop复合物，去除蛋白后，对IP下来的核酸进行二代文库构建和测序[1,2]。

基于S9.6抗体的R-loop检测技术

基于失活的RNaseH的R-loop检测技术

       
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DRIP-seq





DRIP-seq可以实现全基因组水平的R-loop定位，但还是有不足之处，首先样本量需求大，通常需要7-8million的细胞，这对量少的样本，尤其是临床样本不友好。其次，DRIP-seq基因组提取和片段化过程中可能导致一些不稳定R-loop信号的丢失，另外限制性内切酶的偏好性，以及片段化产物kb级别的片段化产物，可能会影响数据的真实性和分辨率。最后操作较繁琐，DRIP-seq整个流程耗时较长，尤其是在基因组提取、DNA回收和建库环节，这些繁琐的操作不仅使整个实验耗时长，还可能会增加实验误差。

DRIP-seq实验流程[3]



03

R-loop CUT&Tag





2021年，武汉大学梁凯威教授团队开发了基于CUT&Tag 的R-loop检测技术，分别利用RNase H1上的HBD结构域和S9.6抗体作为R-loop识别因子，在CUT&Tag体系下进行全基因组范围内的R-loop定位。实验流程包括：ConA磁珠结合细胞、一抗孵育（GST-His-2xHBD或者S9.6）、二抗和三抗孵育，PA-Tn5 孵育，片段化和建库。R-loop CUT&Tag细胞起始量为1*105，不需要内切酶消化，超声片段化，加接头等复杂严苛的步骤，IP过程在活细胞内原位进行，整个实验耗时1-2天，**程度减少对R-loop结构的破坏[4]。
R-loop CUT&Tag 流程






数据分析显示，R-loop CUT&Tag可以在全基因组水平富集R-loop信号，并且这些信号在RNase A和RNaseq H 处理后显著减少，说明检测到的R-loop信号具有真实性和特异性[4]。
   
   




将R-loop CUT&Tag结果和DRIP-seq以及其它R-loop检测技术（Map R，RChIP，DRIPc）结果进行对比，R-loop CUT&Tag表现出更高的信号和信噪比[4]。





R-loop CUT&Tag不仅可以捕获转录起始位点和genebody上的信号，对于瞬时动态的增强子上R-loop信号，也能很好捕获，说明R-loop CUT&Tag具有很强的灵敏性[4]。





最后，对DRIP-seq和R-loop CUT&Tag的区别进行总结：

04

重点来啦





嘉因生物推出自2020年推出CUT&Tag以来，已完成了超过1000+ 样本实验，累计协助客户发表文章78篇，累计影响因子超过600（嘉因生物客户文章合集）。基于丰富的CUT&Tag经验，嘉因生物推出基于S9.6抗体的R-loop CUT&Tag 服务，以期帮助客户得到高质量的R-loop数据。




参考文献：
  1. Zhou J , Zhang W , Sun Q .R-loop:The new genome regulatory element in plants[J].植物学报:英文版, 2022, 64(12):15.DOI:10.1111/jipb.13383.
  2. Sanz L A ,Frédéric Chédin.High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA–RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing[J].Nature Publishing Group, 2019(6).DOI:10.1038/s41596-019-0159-1.
  3. Sanz LA, Castillo-Guzman D, Chédin F. Mapping R-Loops and RNA:DNA Hybrids with S9.6-Based Immunoprecipitation Methods. J Vis Exp. 2021 Aug 24;(174):10.3791/62455. doi: 10.3791/62455.
  4. Wang K , Wang H , Li C ,et al.Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor[J].Science advances, 7(8):eabe3516[2024-05-31]. DOI:10.1126/ sciadv. abe3516.


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