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MeRIP-seq/acRIP-seq
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一、产品概述

1.1 m6A-seq概述

m6AN6-methyladenosineRNA腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰,是真核生物mRNA上常见的一种转录后修饰。m6A修饰在肥胖、癌症、突触信号传递、精子发育、卵子发生、干细胞分化、减数分裂、昼夜节律等生物学过程发挥重要作用。m6A修饰过程中有三大类酶发挥重要作用,分别是WritersErasersReadersWritersm6A甲基转移酶(m6A methyltransferase )主要包括METTL3METTL14WTAP等。去甲基化酶包括FTOALKBH5等。识别甲基化酶包括YTH结构域蛋白、hnRNP以及eIF等。m6A残基分布在mRNA5UTR3UTR,核心motifG[G/A]A*CU*表示潜在的m6A位点)。主要影响mRNA的可变剪切、调节mRNA的翻译及降解。m6A-seq是基于免疫共沉淀的原理结合测序在全转录组水平上定位m6A修饰。

1.2 ac4C-seq概述

N4-乙酰胞苷(ac4C)是在生命所有领域都是保守的三种RNA碱基修饰之一。acRIPseq
利用特异识别ac4C的抗体富集含有ac4C的mRNA片段,并结合高通量测序,实现全转
录组水平的ac4C修饰谱图。

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1.2实验流程

1.提取Total RNA并用Oligo-dT磁珠富集mRNA

2.通过超声破碎或化学试剂将mRNA进行片段化。

3.取片段化的mRNA一部分作为input进行测序;另一部分用带有磁珠的m6A/ac4C抗体免疫沉淀具有m6A/ac4C修饰的mRNA片段。

4.将带磁珠的抗体洗脱掉,留下m6A/ac4C修饰的mRNA片段,随机引物构建cDNA文库,加接头进行测序。

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二、案例解析

Wen J, Lv R, Ma H, et al. Zc3h13 Regulates Nuclear RNA m 6 A Methylation and Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal[J]. Molecular Cell, 2018, 69(6):1028.

m6A是真核生物mRNA丰度较高的一种修饰,通过影响mRNA的稳定性、可变剪切、转运和翻译来动态的调节mRNA。ZC3H13是一种锌指蛋白,在介导细胞核中RNA的m6A甲基化发挥重要作用。在小鼠的胚胎干细胞中敲除Zc3h13降低了mRNA的整体m6A水平。Zc3h13敲除之后,大部分的WTAP、 Virilizer和Hakai转移到细胞质中,表明Zc3h13对于Zc3h13-WTAP-Virilizer-Hakai复合物的细胞核定位是必需的。敲除Zc3h13、WTAP、Virilizer或Hakai,影响了mESCs的干性,进而促进小鼠胚胎干细胞分化。简言之,Zc3h13在细胞核中锚定WTAP、Virilizer和 Hakai复合物进而核中促进核中RNA的m6A甲基化,维持了mESC的自我更新。

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Yoon K J, Ringeling F R, Vissers C, et al. Temporal Control of Mammalian Cortical Neurogenesis by m6A Methylation.[J]. Cell, 2017, 171(4):877.

m6A被一种甲基化转移酶复合物Mettl3/Mettl14所催化,是一种普遍mRNA内部修饰。在胎鼠脑中敲除Mettl14导致了m6A修饰的清除,延长了RGCs细胞周期,胚胎期的皮层推迟了出生后。Mettl3的knockdown导致的现象与Mettl14敲除类似。胎鼠皮层的m6A测序揭示了富集m6A修饰的mRNA与转录因子、神经发生、细胞周期、神经分化有关以及发生了m6A的mRNA会被降解。m6A修饰也调控人前脑类器官的神经发生。通过人和鼠皮质神经发生过程中含有m6A修饰的mRNA比较,研究人员发现这些发生修饰的转录本与人脑紊乱的基因相关。简言之,本研究通过基因干扰和m6A测序揭示了哺乳动物神经发生过程中转录调控的表观机制。

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