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为什么我的研究要使用ATAC-seq


       1)从机制研究的角度,阐述老师关心的生物通路,细胞反应,细胞表型和疾病是否与表观遗传学的调控相关。开疆破土的思维!
       2)快速的决定 表观遗传修饰 是否在老师感兴趣的课题中 起到一定作用 (主要是通过 比较 疾病组和正常组的ATACseq的差异,从而推测表观遗传是否在疾病中起到一定作用)
       案例:
       “我感兴趣的生物学问题跟表观遗传调控有关系吗?我担心直接做ChIP-seq、DNA甲基化等表观实验看不到差异。”这时,不妨先做ATAC-seq,看开放染色质(open chromatin、transposase-accessible chromatin)是否有变化。参考2017年发表在Stem Cell Reports上的这篇文章,用ATAC-seq得出的结论跟前面多种组蛋白修饰实验发现的结论非常一致。

       3)通过ATACseq定义的open chromatin区域 ,再结合motif 分析,识别哪种转录因子参与了基因表达调控(对于抗体质量不好的TF,尤其有效)

     “ 我要研究的是具体的生物学问题,研究某个基因的上下游调控机制,那些揭示基因组普遍规律的文章不适合我。”

       ATAC-seq适合你,它能回答以下三个问题:
      1. 找调控某一生物学过程的关键转录因子
      2. 找哪个转录因子调控了我感兴趣的基因
      3. 找我感兴趣的转录因子调控的靶基因
      颉伟老师2015年那篇Nature可以说是用ATAC-seq找关键转录因子的范本。《表观遗传是怎样遗传的?| 颉伟讲怎样用ATAC-seq研究表观遗传机制的视频》,下面是部分ppt截图,进入链接获取ppt,看视频。
      用ATAC-seq标出早期胚胎发育各时期的开放染色质区域,找出差异,查看差异开放染色质区域富集了哪些转录因子的motif,这些转录因子就是调控2细胞期→4细胞期→8细胞期→囊胚期这一发育过程的关键转录因子。

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ATAC (Assay for Transposase-Accessible Chromatin)



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携带着接头(Adapter)的转座酶复合物进入到染色质开放区域,将处于松散状态的DNA片段化同时末端加上接头。特定成对的PCR引物在DNA片段扩增同时末端加上index,经分选纯化后即为可测序文库。



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Seq (Sequencing)

2 技术目标


       ATAC-seq技术检测染色质开放区域,即Tn5酶可接近的DNA区域,将快速又敏感的表观遗传现象可视化。使用具有50,000个细胞的简单两步方案捕获开放的染色质位点。
转座子优先并入一般没有核小体(无核小体区域)或暴露DNA段的基因组区域。因此,基因组中某些基因座序列的富集表明该区域不存在核小体,处于DNA结合蛋白等核机器能进入的松散暴露状态,提供有关染色质区段转录活跃状态的信息。
       ATAC-seq实验的测序部分通常将产生数百万次可以成功回帖到参考基因组的高通量测序reads。每条reads指向在实验期间发生的一次切割事件在基因组上的位置。然后对回帖到基因组上的reads进行计数,并创建具有碱基对分辨率的信号峰值(peak)。
      在实验过程中DNA可接近的基因组区域(染色质开放区域)含有更多的测序reads(因为这是转座酶优先作用于这些位置)。这些开放位点区域可以进一步分为各种调节元件类型:启动子,增强子,绝缘子等。通过进一步的信息整合,如峰与转录起始位点的距离,产生处于开放区域作用下的基因列表;或计算开放区域内的高倾向结合某种特定蛋白的碱基序列(motif),得到活跃基因的上游调控因子,提供全基因组转录因子发生的信息。
ATAC-seq技术可以进行样本之间差异的染色质开放位点的比较,通常并不单独使用。作为检测表观遗传-染色质开放状态现象的方式,与样本基因表达谱紧密相连,从靶标基因的表观状态关联到表达水平,具有强大的数据挖掘作用。此外,通过关联基因组、外显子,染色质免疫共沉淀(组蛋白修饰或转录因子结合)测序信息,形成:表观调控-基因组-基因表达的完整调控链。


3 技术优势


       1)采用转座酶法进行DNA片段化,将繁琐的DNA片段化、末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应,将实验耗时缩减到2-3小时。
       2)实验步骤简化带来的备样时间跨度缩短和失误概率降低,使实验成功率和可重复性大大提升。
       3)样本需求量从百万级别甚至千万级别降低到为50,000个细胞,相较于被替代技术,样本量缩减了至少1000倍,当样本收集困难时更显示出独特的优势。


4  嘉因生物完成的各类ATAC-seq实验

       目前嘉因生物已经可以在各种样本类型下 完成ATAC-seq实验,包括 新鲜细胞,冰冻组织,各类植物组织,真菌 和 微量细胞。

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                                     新鲜细胞


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                             冰冻组织


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                                          拟南芥组织


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                                            生菜组织

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                                            大豆疫霉菌

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                                        微量细胞


5 ATAC-seq应用


肿瘤发育研究
       Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo Tumor Development by ATAC-seq and FAIRE-seq Open Chromatin Profiling(PLoS Genet 2015 Feb)
       取果蝇眼内触角圆盘组织野生型和对应的不同时期的 Rasv12 + scrib-/- mutation tumor样本,用ATAC-seq检测染色质开放图谱存在的差异。结果发现tumor和正常组织之间,早期肿瘤和晚期肿瘤之间,开放染色质区域存在数以千计的peak差异,说明处于开放状态的染色质区域有所区别。肿瘤中许多enhancer和promoter被激活,结合基因表达谱RNA-seq数据,证实染色质开放区域与临近基因的表达水平相关。
在染色质开放区域内扫描motif来寻找可能存在的转录因子调控,发现 AP-1 和Stat92E对于原癌基因表达和肿瘤的生长发育具有关键的调控作用。

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肿瘤机制研究
       Nfib Promotes Metastasis through a Widespread Increase in Chromatin Accessibility(cell, 2016 July)
选择人小细胞肺癌研究促进癌症扩散转移的背景机制。比较原发性和肝转移性的小细胞肺癌细胞之间的差异。两种类型分别来自于4只小鼠重复共计8个样本,利用ATAC-seq,发现NFI家族转录因子富集在差异的染色质开放位点中,预示着NFI家族转录因子在调控肿瘤细胞转移中扮演着重要角色。在染色质高开放性位点区域伴随着Nfib拷贝数量增大,且Nfib在侵袭性原发性肿瘤和转移性肿瘤内高表达,Nfib表现出维持染色质及远端调控区域开放和促进神经基因表达的功能,说明了Nfib对促进癌细胞增殖和迁移的重要作用及调控机制。

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肿瘤细胞特性研究
       Authentication and characterisation of a new oesophageal adenocarcinoma cell line: MFD-1. (science reports, 2016 April)
      从55岁的男性病人中获取了一种新的食管癌细胞系:MFD-1,采用ATAC-seq方法与经典的食道癌细胞系OE33和人食管上皮细胞HET1A比较差异,进行MFD-1癌细胞特性研究,绘制MFD-1染色质开放位点图谱。和正常上皮细胞相比,MFD-1特异的染色质开放位点显著富集着CTCF、NFY、Meis3 、Nrf2 的motif,且这些位点附近基因富集在和上皮癌及消化道肿瘤相关的功能分组内。
结合全基因组测序(WGS)和表达谱测序(RNA-seq)技术,发现细胞系中4 个基因(ABCB1, DOCK2, SEMA5A 和TP53)存在5个突变位点,提供了MFD-1的基因表达特性。说明MFD-1能作为一种代表性的临床前原发性食管癌模式细胞系,可用于对应突变类型的研究。

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